革兰氏染色法的基本原理是根据结晶紫初染和碘液媒染后，在植物细胞内产生了不溶解水的结晶紫与碘的一氧化氮合酶，革兰氏阳性菌因为其植物细胞偏厚、肽聚糖网层级较多且化学交联高密度，故遇酒精褪色解决时，因缺水反倒使网眼变小，再再加它没有脂质，故酒精解决不容易出現间隙。
因而可以把结晶紫与碘一氧化氮合酶紧紧留到壁内，使其仍呈蓝紫色；而革兰氏阳性菌阴性菌因其植物细胞薄、外膜层脂质成分高、肽聚糖层薄且化学交联度差。
在遇脱色剂后，以脂质主导的外膜快速融解，薄而疏松的肽聚糖网不可以阻拦结晶紫与碘一氧化氮合酶的总混，因而根据酒精褪色后仍呈没有颜色，再经过沙黄等鲜红色染剂复染，就使革兰氏阳性菌阴性菌呈鲜红色。
病菌先经过碱性染料结晶紫上色，而经碘液媒染后，用乙醇褪色，在一定标准底下的病菌蓝紫色不被脱下，有的可被脱下，因而可把病菌分成两类，前面一种称为革兰氏阳性菌（G ），后面一种为革兰氏阳性菌阴性菌（G－）。
为观查便捷，褪色后再用一种鲜红色染剂如偏碱蕃红、稀释液复红等开展复染。阳性菌仍带蓝紫色，阴性菌则被沾染鲜红色。有芽胞的链球菌和绝大部分的革兰阴性杆菌，及其全部的放线菌和细菌都呈革兰氏阳性菌正反映；弧菌，球菌和大部分高致病的无芽胞链球菌都展现负反映。
普遍的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌（Staphylococcus）、链球菌感染(Streptococcus)、肺炎双球菌、炭疽菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。
普遍的革兰氏阳性菌阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌及霍乱弧菌等。
